Phương pháp enzyme được Sanger và các cộng sự phát minh cũng vào khoảng thời gian 1977, cùng ngày hôm nay phương pháp này ngày càng được hoàn thiện và thực hiện dễ dàng tại những phòng thí nghiệm.
Bạn đang xem: Phương pháp enzyme học
Nguyên tắc phổ biến của phương thức này có thể tóm tắt như sau:
Hình 1: phương thức Enzyme giải trình từ bỏ DNA. Đoạn DNA được chèn vào một vector trên một vị trí hiểu ra trình tận. Vào tự, nhờ vào hình đó các rất có thể nucleotide tổng hợp tiến công được dấu các * là mạch các nucleotide đối chọi có một được đầu là dánh mồi, vệt một 35S, đầu nhờ là các vậy nucleotide các mạch solo được tấn công dấu.
Trước hết chèn những đoạn DNA đề xuất phải xác minh trình tự vào một trong những vector là phage xuất xắc plasmid tại một vị trí mà trình tự chuỗi của địa chỉ này sẽ được xác minh rõ. Chuyển thể tức là đưa các vector với đoạn chèn DNA này vào tế bào vi trùng để nhân phiên bản các vector này thành nhiều bản sao, sau đó tách chiết cùng tinh khiết những vector từ vi trùng để thành các vector tự do.
Dùng các đoạn mồi bổ sung một bí quyết đặc hiệu với trình trường đoản cú của vector tại địa điểm chèn đoạn DNA. Cấp dưỡng ống phản nghịch ứng men DNA polymerase cùng 4 các loại nucleotide tự do thoải mái (gọi là d
NTP: deoxynucleotide triphosphate) với một lượng cực kỳ giới hạn những nucleotide tận (terminator, là dd
NTP: dideoxynucleotide triphosphate, cũng giống như d
NTP, tất cả 4 một số loại dd
NTP khớp ứng với 4 base A, T, C cùng G). Phản nghịch ứng được tiến hành trong 4 ống, và mỗi ống mang đến một một số loại dd
NTP khác nhau. Bước đầu từ đoạn mồi, men DNA polymerase đang kéo các d
NTP vào nhằm tổng hợp mạch đơn bổ sung với mạch DNA chèn trên vector, với sự tổng vừa lòng mạch đơn sẽ bị tạm dừng tại vị trí nhưng mà dd
NTP được kéo vào thay vày d
NTP. Vì sao sự tổng đúng theo bị dừng lại là vì dd
NTP có cấu tạo hóa học tập bị mất đi cội OH tại địa điểm carbon đồ vật 3 của con đường deoxyribose, mà lại gốc OH tại địa chỉ này chính là nơi để d
NTP sau đó được thêm vào. Nhờ vậy trong ống phản bội ứng có các mạch đối kháng DNA có những chiều dài khác nhau tương ứng với những vị trí trình tự những nucleotide bên trên đoạn DNA nơi bắt đầu (hình 1).
Để giải trình tự, bạn ta dùng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide vươn lên là tính. Với phương thức đánh vệt mồi hay các d
NTP bằng đồng vị phóng xạ 32P hay 35S thì sau khi điện di, cũng tương tự như như cách thức của Maxam và Gilbert, tín đồ ta vạc hiện các vạch điện di bởi kỹ thuật xạ cam kết tự ghi, và từ những vạch này giải được trình từ bỏ của đoạn DNA (hình 2).
Hình 2: Hình xạ ký tự ghi một tác dụng giải trình tự DNA trên gel polyacrylamide. Từ công dụng này, hiểu được trình từ bỏ DNA
Lượt xem: 6.873
Michele VitoloĐại học kỹ thuật Dược phẩm, Đại học Tổng vừa lòng São Paulo, Brazil.NGHE ĐỌCYour browser does not tư vấn the audio element.TỔNG quan tiền VỀ QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME
(xemdiemthi.edu.vn) Vì tất cả các enzym có giá trị thương mại dịch vụ đều là protein bắt buộc chúng rất có thể được sản xuất thông qua các quy trình sử dụng các thao tác làm việc đơn vị tương tự, tức là chiết xuất xuất phát điểm từ 1 nguồn (động vật, thực đồ hoặc vi sinh vật), lọc, ly tâm, kết tủa, tinh chế, làm cho khô, ổn định định, tiêu chuẩn chỉnh hóa cùng đóng gói. Trong technology sinh học, tất cả các hoạt động đơn vị giữa quy trình lọc cùng đóng gói được call là quá trình xử lý hạ nguồn.
Enzyme có nguồn gốc động vật với thực trang bị được tạo thành ra bằng cách tạo ra những mô, cơ quan, lá và trái cây - thường xuyên là các vật liệu còn còn sót lại từ hoạt động chăn nuôi và nông nghiệp & trồng trọt của con vật -, kế tiếp được tách xuất bằng nước hoặc dung môi hữu cơ. Khía cạnh khác, enzym vi sinh thiết bị thu được từ tế bào nhân sơ (vi khuẩn) hoặc tế bào nhân thực (chủ yếu đuối là mộc nhĩ men) được nuôi cấy trong môi trường xung quanh lỏng hoặc phân phối rắn và được tiến hành trong một lò phản bội ứng quan trọng đặc biệt gọi là lò lên men. Quá trình này được gọi là quy trình lên men.Quá trình nuôi cấy chào bán rắn - được sử dụng trên quy mô phệ lần thứ nhất vào năm 1894 để phân phối amylase trường đoản cú Aspergillus oryzae được trồng trong khối gạo nấu nướng chín ẩm trong một tuần (“Quy trình Koji”) xẩy ra như sau: a) dạng bán rắn môi trường thiên nhiên (ngô, lúa mì, đậu nành, gạo, hoặc cám lúa mạch) chịu những tia hơi để nấu chín cùng khử trùng; b) môi trường xung quanh bán rắn được phân bố đồng đều trong các khay được ghép chủng vi sinh đồ thuần khiết, thường là nấm; và c) quy trình lên men ra mắt trong đk vô trùng vào một tuần. Môi trường thiên nhiên lên men chào bán rắn có chứa enzym mong muốn muốn có thể được xử trí bằng một trong hai quy trình. Ví như muốn sẵn sàng enzyme thô, môi trường thiên nhiên lên men cung cấp rắn được chuyển trực tiếp vào quy trình làm khô, nghiền cùng sàng, kế tiếp là tiêu chuẩn hóa cùng đóng gói sản phẩm cuối cùng. Quy trình khác bao gồm gửi môi trường lên men chào bán rắn để triết xuất trong nước, lọc, ly tâm, kết tủa, tinh chế, làm cho khô, ổn định, tiêu chuẩn hóa và đóng gói sản phẩm cuối cùng. Quá trình bán rắn hiệu quả để thu được những enzym ngoại bào (pectinase, amylase cùng cellulase) được vi sinh vật bài trừ vào môi trường.Trong môi trường nuôi ghép chìm, vi sinh đồ được duy trì ở tâm trạng huyền phù thông qua sự khuấy động tiếp tục trong những điều kiện cải cách và phát triển có điều hành và kiểm soát (p
H, sức nóng độ, hóa học dinh dưỡng, oxy hóa, v.v.) môi trường là dung dịch nước bao gồm các chất túi tiền thấp như thủy phân tinh bột, mật đường, ngô dốc. Rượu, váng sữa cùng nhiều một số loại ngũ cốc. Khi xong quá trình lên men, enzym có thể có vào vi sinh đồ gia dụng hoặc được bài tiết vào môi trường. Khi bên phía trong tế bào, huyền phù được ly tâm hoặc lọc, phần nổi bên trên hoặc dịch thanh lọc được thải ra ngoài và thu nhận bánh tế bào; nếu như không, bánh tế bào bị loại bỏ bỏ với pha lỏng được thu thập. Tùy trực thuộc vào enzym vào hoặc quanh đó tế bào, quá trình lên men buộc phải được tiến hành theo cách tương ứng với sự phát triển của tế bào.
Da. Các phân tử rất bé dại đi qua màng và các phân tử lớn được giữ lại trên mặt phẳng bộ lọc. Các phân tử có size trung gian được lưu giữ trong hóa học nền màng và ở đầu cuối làm tắc những lỗ chân lông. Vì lý do này, những bộ lọc vi xốp sẽ được sửa chữa thay thế cho những màng khuếch tán. Thật vậy, màng khuếch tán được hiện ra bởi hàng ngàn lớp polyme đặc biệt quan trọng xếp chồng lên nhau một biện pháp chắc chắn, qua đó những phân tử gồm MW tốt nhất định hoàn toàn có thể xâm phạm từng lớp khi được tác động vào một trong những điện ngôi trường - chức năng qua màng - hoặc gradient nồng độ, áp suất hoặc nhiệt độ độ. Nói cách khác, rất lọc về cơ phiên bản là sự khuếch tán phân tử khắp màng. Vì đó, sự vận động của một phân tử qua màng đòi hỏi động năng và xảy ra dễ dãi hơn ở ánh nắng mặt trời cao. Màng dễ thấm được thuận lợi ngậm nước và gồm một polyme tất cả ái lực riêng dạn dĩ với dung môi của nó. Ngược lại, màng cứng tương đối mất nước có tính ngấm thấp, đặc biệt quan trọng khi ái lực giữa polyme màng cùng dung môi bị giảm.Theo nghĩa chung nhất, màng tổng hợp là 1 hàng rào chia cách hai trộn và hạn chế sự vận chuyển của các chất hóa học khác biệt theo một phương thức cụ thể. Một màng có thể đồng nhất hoặc ko đồng nhất, kết cấu đối xứng hoặc ko đối xứng. Nó có thể là trung tính, có thể mang năng lượng điện dương hoặc âm, hoặc có thể là lưỡng cực. Độ dày của nó gồm thể biến hóa từ dưới 100 nm mang lại hơn một cm. Điện trở có thể biến đổi từ vài mega ohm đến một trong những phần nhỏ của ohm. Thuật ngữ "màng" bao gồm nhiều loại vật tư và kết cấu khác nhau, cùng màng thường rất có thể được mô tả xuất sắc hơn về công dụng của nó rộng là về công dụng của nó. Toàn bộ các thứ liệu vận động như màng đều có một công dụng chung: chúng hạn chế sự đi qua của các loại hóa chất khác biệt theo một giải pháp rất núm thể. Màng ko đối xứng là bộ lọc mặt phẳng và giữ lại tất cả các đồ gia dụng liệu bị nockout bỏ ở bề mặt nơi chúng rất có thể được thải trừ bằng lực cắt công dụng bởi dung dịch cấp dịch rời song tuy vậy với mặt phẳng màng. Cái gọi là “phân rất màng” là 1 trong những hiện tượng vày sự tích tụ của hóa học tan bị nockout bỏ trên bề mặt màng. Điều này cản trở cái dung môi, vị đó sau cùng nó rất có thể không còn bội nghịch ứng với sự tăng thêm áp suất thủy lực. Do đó, việc kiến thiết thiết bị khôn xiết lọc nhằm mục tiêu mục đích bớt thiểu sự tích tụ của những lớp phân cực như vậy, trong thiết bị bài bản nhỏ bằng phương pháp khuấy cùng trong thiết bị mập hơn bằng cách duy trì vận tốc dòng chất lỏng cao trên bề mặt màng. Chúng được sử dụng chủ yếu trong số quy trình màng triết lý áp suất, ví dụ như thẩm thấu ngược, rất lọc hoặc tách khí. Nói phương pháp khác, những ứng dụng của các quá trình này để phân lập enzym - hoặc một dạng phân tử sinh học khác - ngơi nghỉ quy mô thí điểm và lever công nghiệp được triệu tập vào nồng độ.Khi các màng vi lọc và khôn xiết lọc đang được cải cách và phát triển và cải tiến, một thiết bị được hotline là lò bội phản ứng màng cũng sẽ được phát triển. Thiết bị này rất có thể được sử dụng trong những quy trình tiếp tục bằng enzyme thay thế cho các lò phản nghịch ứng thường thì (chủ yếu là lò bội phản ứng bể khuấy liên tục, lò phản bội ứng đóng gói hoặc tầng sôi). Theo phép tắc chung, những lò bội phản ứng thông thường chuyển động với enzyme được links với chất hỗ trợ trơ không hòa tan, trong khi lò bội phản ứng màng tất cả thể chuyển động với enzyme không có trong hỗn hợp hoặc link với màng (enzyme được giới hạn trên mặt phẳng hoặc trong màng). Lò bội nghịch ứng màng rất có thể được định bên cạnh đó một lò làm phản ứng bể khuấy tiếp tục kết phù hợp với màng bán thấm hoặc như một lò phản nghịch ứng sợi rỗng, có nghĩa là một bể đựng không phải khuấy đựng đầy một bó ống sợi rỗng xếp thẳng của màng chào bán thấm. Mặc dù nhiên, sự sắp xếp màng / chất xúc tác sinh học có thể liên quan tiền hoặc không liên quan giữa chúng. Nếu như chúng link với nhau, màng vào vai trò xúc tác và mặt phẳng ngăn bí quyết đồng thời; trường hợp không, nó chỉ vận động như một mặt phẳng ngăn cách. Khi enzym làm việc dạng hòa tan, lò làm phản ứng màng hoàn toàn có thể liên quan tới việc tái chế enzym ( lò bội phản ứng bể khuấy thường xuyên và mô-đun màng khôn cùng lọc được liên kết theo chuỗi, hay được gọi là bimodule-lò bội nghịch ứng màng) hoặc ko (màng cực kỳ lọc được điều chỉnh cho phù hợp với đáy lò phản nghịch ứng bể khuấy thường xuyên như trong một tế bào cực kỳ lọc được khuấy trộn, hay được gọi là unimodule-lò bội phản ứng màng). Các tính năng chuyển động chính của lò làm phản ứng màng là xúc tác đồng nhất, hoạt tính cao trên một đơn vị thể tích, không có hiệu ứng cấu tạo và khuếch tán và - nếu đề nghị - lò bội nghịch ứng màng hoàn toàn có thể được quản lý trong điều kiện vô trùng cũng giống như với các hệ thống đa enzym. Những tuấn kiệt đó sẽ dần thay đổi sở mê thích của ngành từ các lò phản ứng enzym cố định truyền thống (lò bội phản ứng đóng gói hoặc tầng sôi với lò phản nghịch ứng bể khuấy thường xuyên ) lịch sự lò bội nghịch ứng màng. Xu thế này ra đời khi áp dụng lò bội nghịch ứng màng trong hàng trăm quy trình, dẫn đến các loại sản phẩm (axit gluconic, glucose, fructose, cyclodextrins, cathecol, v.v.)Ly trọng tâm và lắng.Các hoạt động đơn vị này đều dựa trên sự biệt lập về tỷ lệ giữa những hạt không kết hợp và chất lỏng xung quanh. Quy trình lắng nhờ vào trọng lực, lắng để có được sự phân bóc rắn-lỏng, với thường được thực hiện trong những bể mẫu chảy hình chữ nhật hoặc hình tròn. Ly tâm tương quan đến việc áp dụng cơ học tập của lực ly trung ương để thu được hóa học cô sệt rắn cùng phần nổi phía trên được thiết kế rõ.Ly tâm đã trở thành một kỹ thuật phổ cập để sa thải chất rắn, quan trọng trong phần đông trường thích hợp lọc không hề muốn hoặc không tác dụng (chẳng hạn như loại bỏ vật liệu dạng keo hoặc sền sệt).Có một trong những loại sản phẩm công nghệ ly trọng tâm để phân lập enzyme. đồ vật ly tâm chén bát dạng ống, thiết bị ly tâm các buồng, thiết bị ly tâm đĩa, thứ ly trọng điểm cuộn chén đặc và máy ly vai trung phong giỏ đục lỗ được áp dụng chủ yếu.Khi lực ly tâm bạo dạn hơn lực lôi kéo hàng ngàn lần, ví dụ như 500.000 lần, thì buổi giao lưu của bộ vô cùng ly trung khu xảy ra. Khi các dung dịch keo dán giấy được đặt trong số ô của rôto rất ly trung tâm (quay khoảng tầm 60.000 lần / phút), chúng buộc phải chịu một lực dựa vào vào gia tốc góc của rôto và khoảng cách của những hạt keo dán giấy so với trục quay. Tốc độ hoạt động của các hạt phụ thuộc vào lực này, hình dạng, kích thước và tỷ lệ của những hạt cũng tương tự mật độ và độ nhớt của môi trường xung quanh huyền phù. Đối với những chất đồng nhất, trong những số ấy các hạt kiểu như nhau, các hạt chuyển động với lực ly trọng tâm theo một oắt giới dung nhan nét vào môi trường, trong lúc hỗn hợp của các loại hạt khác nhau hỗ trợ nhiều nhãi con giới và vùng mờ. Siêu ly vai trung phong được thực hiện trong việc bóc các phân đoạn ti thể, microomal cùng hạt hiền lành các tế bào tế bào bị loại gián đoạn, tương tự như trong việc bóc và tinh chế những protein vi rút xáo trộn với những protein mô.Keo tụ và đông tụ.Sự đông tụ là kết quả của sự kết dán trực tiếp giữa những hạt rất nhỏ dại trong môi trường thiên nhiên do sự trung hòa điện tích của những hạt bằng cách thêm các ion nhiều hóa trị có điện tích trái lốt (muối vô sinh hoặc polyelectrolyte hữu cơ), vị đó có thể chấp nhận được kết tụ.Keo tụ là sự hình thành những tập hợp hết sức hở, trong các số đó chất chế tạo bông (gelatin, polyme tổng vừa lòng tích năng lượng điện hoặc không tích điện) vận động như một ước nối mở rộng giữa các hạt. Các ion vô cơ chẳng thể gây keo dán tụ, mặc dù chúng rất có thể được thực hiện để trung hòa điện tích và hỗ trợ quá trình keo tụ. Mặc dù nhiên, các chất polyelectrolytes hữu cơ có thể gây ra hiện tượng kỳ lạ đông tụ và tạo bông đồng thời.Những nghệ thuật này vẫn được áp dụng cho toàn cục tế bào, miếng vụn tế bào và protein không tổ hợp (bao có cả enzyme).
Xem thêm: Phương pháp ôn thi thpt quốc gia hiệu quả trong thời gian ngắn
Sự cách biệt tế bào.Nếu sản phẩm mong muốn là 1 trong những chất nội bào (ví dụ, glucose 6-phosphate dehydrogenase từ Saccharomyces cerevisiae), thì sự phá tan vỡ tế bào là một trong những bước đầu quan trọng đặc biệt trong quy trình thu hồi sản phẩm cũng chính vì các lớp phủ bọc tế bào (màng tế bào chất và thành tế bào) là gần như rào cản thoải mái và tự nhiên để giải thổi phồng phân tử vào môi trường thiên nhiên nuôi cấy. Các phương pháp được sử dụng để phá đổ vỡ vi sinh vật rất có thể được phân nhiều loại là cơ học tập (đông giá buốt / tung đông, hết sức âm, máy nghiền dyno với keo, sản phẩm ép Gaulin / Manton cùng Pháp, máy nghiền bi) và phi cơ học tập (xử lý bằng kiềm, chất tẩy cọ hoặc dung môi hữu cơ, sốc thẩm thấu, đông lạnh - sấy khô, tiêu hóa bằng enzym, v.v.). Công dụng của một nghệ thuật phá vỡ rõ ràng thường được review dựa trên cường độ phá vỡ tế bào với / hoặc là tầm độ buổi giao lưu của enzym được phục hồi, hoặc toàn bô protein phối hợp trong huyền phù bị phá vỡ. Mặc dù bước phá vỡ lẽ tế bào bổ sung làm tăng thêm chi phí sản xuất các chất nội bào so với các sản phẩm ngoại bào, nhưng lại đây ko phải là một nhược điểm. Đối với việc sản xuất các sản phẩm có giá trị cao trường đoản cú vi sinh vật, cũng như từ những mô thực đồ dùng hoặc động vật, giá thành tăng thêm ít quan trọng. Rộng nữa, giá cả sản xuất hoàn toàn có thể được sút xuống bằng phương pháp cô lập đồng thời một trong những sản phẩm sau quy trình phá đổ vỡ tế bào với / hoặc hòa hợp trong môi trường lên men.Khai thác.Chiết xuất là 1 trong thuật ngữ chung tức là phân lập enzym từ bỏ dịch chiết không tồn tại tế bào thô. Việc phân lập hoàn toàn có thể được tiến hành thông qua hết sức lọc - một các bước phân tách trực tiếp; chỉ việc sử dụng một màng gồm độ cắt thích hợp để giữ giàng enzyme mong ước hoặc các thành phầm phụ không mong muốn chiết xuất bằng dung môi hoặc khối hệ thống hai trộn trong nước.Chiết xuất những chất ưa béo bằng dung môi cơ học không kết hợp trong nước là 1 trong quá trình tách rời được tùy chỉnh cấu hình tốt trong ngành công nghiệp hóa chất, có thể được thực hiện trên bài bản lớn. Triết xuất cũng đóng một vai trò quan trọng đặc biệt trong việc phân lập phòng sinh. Quy trình chiết xuất chống sinh điển hình liên quan tới sự việc chuyển hóa học tan từ môi trường lên men đã được gia công rõ sang pha hữu cơ, tiếp theo sau là tinh chiết lại sản phẩm cô sệt trong hỗn hợp đệm nước. Bởi đó, quá trình hai bước phối hợp cô đặc sản phẩm với quá trình tinh chế. Thu hồi sau cùng thường đạt được bằng phương pháp kết tủa, kết tinh hoặc cất cánh hơi.Quá trình chiết hai pha trong nước đến phép bóc tách các enzym khỏi hỗn hợp những phân tử sinh học trong điều kiện nhẹ. Kỹ thuật này dựa vào sự phân chia các phân tử sinh học giữa hai trộn lỏng lộ diện khi hai polyme không tương thích - chẳng hạn như polypropylene glycol và hydroxypropyldextran - được hòa hợp vào nước, với 1 polyme chỉ chiếm ưu thế trong những pha. Tương tự, rất có thể xảy ra nhì pha nước khi mang đến polyme vào hỗn hợp muối nước trên một nồng độ độc nhất vô nhị định. Khi một hỗn hợp những phân tử sinh học, ví dụ, môi trường xung quanh lên men, dịch nuôi cấy tế bào nổi hoặc huyền phù của các tế bào bị con gián đoạn, nhận thêm vào khối hệ thống hai pha nước, mỗi loại phân tử sinh học sẽ phân chia duy nhất giữa nhị pha. Ưu điểm của hệ thống này là tính cân xứng sinh học tập cao và độ căng mặt phẳng thấp, độ sắc nét và năng suất cao, tăng quy mô đường tính lên khoảng 2x104 lần so với đồ sộ phòng thể nghiệm và sử dụng trực tiếp technology kỹ thuật hóa học có sẵn (thiết bị chiết lỏng-lỏng) cho sự phân tách quy mô công nghiệp.Phân vùng ái lực, như sẽ đề cập sinh hoạt trên, dựa trên sự tương tác ưu tiên thân phân tử với một phối tử vắt thể. Sự cửa hàng dẫn mang lại một tinh vi phối tử-phân tử sinh học phân loại có lựa chọn lọc vào trong 1 trong những pha, nhằm lại những chất hoặc protein gây độc hại trong pha còn lại. Ví dụ, glucose-6-phosphate dehydrogenase tự men làm bánh được tinh chế 2,4 lần với hiệu suất 67% trong hệ thống hai pha nước cùng với sự hiện hữu của thuốc nhuộm triazine.Một trở thành thể của khối hệ thống được miêu tả là chiết lỏng-lỏng bằng các mixen đảo ngược, một qui định hữu ích và linh hoạt không giống để bóc các enzym. Khối hệ thống micelle đảo ngược bao hàm tập hợp các phân tử chất hoạt động bề mặt có cất lõi nước bên trong được phân tán trong môi trường xung quanh dung môi hữu cơ. Môi trường vi phân cực bên phía trong micelle hòn đảo ngược cho phép hòa tung protein trong lúc vẫn duy trì cấu trúc lúc đầu của nó. Quá trình này được thực hiện theo hai bước, có nghĩa là chiết xuất thuận, trong những số đó protein phương châm được đưa từ dung dịch nước lịch sự pha cơ học dạng micelle đảo ngược, và chiết xuất ngược lại, qua đó protein được đưa từ các mixen đảo ngược sang trộn nước mới. Từ đó nó được phục sinh sau đó. Sự phân tách bóc cũng có mức giá trị trường hợp protein đích vẫn còn đấy trong trộn nước và các chất gây ô nhiễm và độc hại chuyển sang những mixen hòn đảo ngược. Trong trường vừa lòng này, bài toán thanh lọc dễ dàng và kinh tế hơn bởi đã loại trừ được bước chiết xuất sau. Do thực chất tĩnh điện của việc tương tác giữa protein / các mixen đảo ngược, cường độ ion của dung dịch nước đóng góp một vai trò đặc biệt trong tác dụng của quá trình chiết lỏng-lỏng. Bằng cách thay đổi cường độ ion của môi trường thiên nhiên một biện pháp thuận tiện, protein có thể được chuyển mang lại hoặc đào thải khỏi micelle hòn đảo ngược, tương ứng, ở cường độ ion rẻ hoặc cao. Một quan lại điểm xuất sắc là áp dụng kỹ thuật này trực tiếp trong chất đồng điệu của vi sinh đồ thô nhằm mục đích mục đích loại bỏ một một số loại enzyme hoặc protein chũm thể. Ví dụ, các enzym xylose reductase với xylitol dehydrogenase, được tinh chế bằng thông số 4,8 và 2,3, tương ứng, được bóc tách trực tiếp khỏi chất đồng nhất không có tế bào thô bằng các micelle đảo ngược của N-Benzyl-N-Dodecyl-N-bis (2- hydroxyetyl) amoni clorua (BDBAC) chất hoạt động bề mặt cation.Sự kết tủa.Đây là một trong những quy trình trong số ấy việc thêm thuốc thử hoặc chuyển đổi điều kiện tạo nên protein rời khỏi dung dịch và chế tác thành các hạt không hòa tan.Có một số cách để thực hiện tại kết tủa đại phân tử: a) muối hạt hóa: kết tủa protein bằng phương pháp sử dụng muối trung tính - đa phần là amoni cùng natri sunfat - sinh hoạt nồng độ cao; b) Sự thay đổi pH: nhằm mục đích kết tủa protein trên điểm đẳng điện của nó (p
H nhưng mà điện tích bình thường của đại phân tử bằng không); c) tempera sự thay đổi chắc chắn: nhiệt độ được tạo thêm từ từ bỏ để hệ trọng sự thay đổi tính của các protein không ý muốn muốn, cùng protein ước muốn vẫn bị hòa tan; d) kết tủa bằng dung môi hữu cơ (etanol, metanol, axeton hoặc dietyl); e) sự kết tủa bởi polyme có trọng lượng phân tử cao: nó dựa trên tác động của polyme đối với sự shop của protein với môi trường nước của nó. Hiện tượng xảy ra do sự chèn của polyme vào mặt ngăn cách protein-nước. Polyetylen glycol 6000 MW (PEG 6000), được trộn cùng với nước ở nồng độ 1/2 (wt / wt), là chất kết tủa và bất biến protein tác dụng ở nhiệt độ phòng. Rộng nữa, nó là 1 thuốc thử phải chăng tiền, bao gồm sẵn bên trên thị trường, với nó không buộc phải phải vứt bỏ trước lúc hấp phụ bàn bạc ion - nếu các bước xuôi dòng dự kiến rằng sẽ có kết tủa sau các bước sắc ký này; và, f) kết tủa bởi muối mangan hoặc streptomycin sulfat: tiến trình này nhằm mục đích mục đích loại bỏ axit nucleic khỏi dịch tách không tế bào trong vấn đề cô lập các enzym nội bào vì sự hiện hữu của axit nucleic (MW tự 25x103 cho 1x106) làm tăng mức độ nhớt trung bình, làm bớt năng suất của sự việc phân bóc trong kết tủa phân đoạn cùng / hoặc nhan sắc ký.Sắc ký.Sắc ký hoàn toàn có thể được định nghĩa là việc thấm phần lớn của chất lỏng sang 1 cột cất đầy chất được phân loại mịn có thể làm lờ đờ một phương pháp chọn lọc những thành phần khăng khăng của chất lỏng. Để phân lập enzyme, đa số các phép tách sắc ký kết được thực hiện trong môi trường nước hoàn toàn.Có một số phương pháp sắc ký để bóc tách hoặc tinh luyện các sản phẩm sinh học. Các phương pháp chính là a) sắc ký dàn xếp ion: điện tích phân tử là cơ sở của việc phân tách; công dụng của nó là đáng chú ý ở quy trình tiến độ đầu hạ nguồn, địa điểm xử lý khối lượng lớn; độ phân giải, năng lực lưu giữ và tốc độ phụ thuộc vào chất nền được áp dụng (ví dụ như hóa học đồng trùng hợp divinyl-styren, xenluloza kết tinh hoặc dextran); nó hoàn toàn có thể được áp dụng theo lô hoặc với các quy trình liên tục; b) sắc đẹp ký tác động kỵ nước: theo sau lực Van der Waals và xúc tiến steric giữa chất tan và chất nền (ví dụ như phenyl agarose); độ phân giải, tài năng lưu giữ lại và vận tốc có liên quan; nó có thể được áp dụng ở bất kỳ giai đoạn làm sao của quy trình hạ lưu, tuy vậy sự phân bóc tách lớn nhất xảy ra khi cường độ ion của môi trường cao, nhà yếu sau khoản thời gian ngâm muối; c) thanh lọc gel: khả năng phân tách dựa trên form size và hình dạng của các chất tan liên quan đến đường kính hạt hình ước gel, để những phân tử chất tan bé dại đi vào những hạt cùng đi sang 1 thể tích lưu giữ tác dụng lớn hơn trong khi những phân tử phệ nhất bao quanh các hạt nổi lên trước. Trường đoản cú cột gel; thông lượng qua cột cao, nhưng có độ phân giải vừa phải kê phân đoạn; nó tác dụng để khử muối bột và bàn bạc bộ đệm; d) Sắc ký ái lực: dựa vào ái lực sinh học, độ chọn lọc, kỹ năng lưu duy trì và tốc độ của chúng nhờ vào vào các loại phối tử được sử dụng (kháng thể solo dòng, hóa học ức chế quánh hiệu, đồng yếu hèn tố, cơ chất biến hóa tính, v.v.); nếu phối tử bị rứa định bằng phương pháp gắn cùng hóa trị vào hóa học nền không phối hợp (xenluloza hoặc polyacrylamit), thì protein quan lại tâm, khi thể hiện ái lực với phối tử của nó, vẫn trở nên link và tự ráng định. Khi những protein tạp nhiễm được các loại bỏ bằng cách lọc cùng rửa sạch chất nền, protein quan tâm sẽ tiến hành rửa giải khỏi hóa học nền bằng cách bổ sung nồng độ dài của phối tử thoải mái trong dung dịch; tuy nhiên nó hoàn toàn có thể được sử dụng ở ngẫu nhiên giai đoạn như thế nào của các bước hạ lưu, khuyến nghị là sử dụng nó khi lượng protein và các chất gây ùn tắc đã được giảm mạnh bởi các quy trình không giống rẻ hơn.Kết tinh.Tinh thể là mọi thể được hình thành bởi vì sự đông quánh trong điều kiện thuận tiện của một thành phần hóa học, một hợp chất hoặc một tất cả hổn hợp đẳng hình với việc sắp xếp bên trong thường xuyên lặp lại của những nguyên tử của nó.Kết tinh là một quy trình - được triển khai trong lô hoặc thứ kết tinh tiếp tục - trong đó một chất kết tinh từ hỗn hợp quá bão hòa. Điều này rất có thể đạt được bằng phương pháp làm lạnh dần dung dịch xuống dưới ánh nắng mặt trời bão hòa hoặc bằng cách làm cất cánh hơi dung môi ở ánh nắng mặt trời không thay đổi trên nồng độ bão hòa của chất. Làm bay hơi đơn giản và dễ dàng là một kỹ thuật hữu dụng để các enzym không bị tổn hại vị sự gia tăng nồng độ của các chất tan có MW thấp với nó cũng bất biến ở nhiệt độ cao cần thiết để quy trình xảy ra với tốc độ đáng kể. Kết tinh là cách thức ưa say đắm để tạo ra thành sản phẩm cuối cùng vì độ tinh khiết không nhỏ là khả thi. Những tinh thể enzyme tinh khiết để phân tích tinh thể hoặc áp dụng trong chế phẩm (lysozyme, hyaluronidase, superoxide dismutase, urokinase, uricase, v.v.) hoàn toàn có thể thu được tự dung dịch đã có được khử trùng trước đó hoặc ko bằng phương pháp siêu lọc. Khi có thời hạn để đạt đến trạng thái cân nặng bằng, độ trong sáng của tinh thể đang cao nếu như không thì độ tinh khiết đã nghèo.Quá trình tạo thành muối thường thì của một enzym với amoni sulfat cần yếu được xem là một một số loại kết tinh vì chưng kết tủa là 1 bánh vô định hình của các phân tử enzym chứ không phải của các thực thể kết tinh.Kết tinh là quá trình tinh chế cuối cùng có thể chấp nhận được thu được những sản phẩm sau cuối (protein, enzym, hóa chất tốt, v.v.) cùng với độ tinh khiết thừa trội, dễ xử lý, thời hạn sử dụng vĩnh viễn và hiệ tượng dễ chịu. Kết cấu ba chiều cụ thể của khoảng tầm tám trăm protein đã được thiết lập bằng cách thức tinh thể học tập tia X (chùm tia X được truyền sang một tinh thể của protein).Làm khô.Trước lúc xử lý, đóng gói cùng lưu trữ, các sản phẩm sinh học tập tinh khiết phải không có nước hoặc dung môi hữu cơ còn sót lại. Điều này có thể được thực hiện bằng cách sấy phun và sấy đông lạnh. Cả nhì kỹ thuật đều được cho phép loại vứt nước hoặc dung môi không giống một biện pháp nhẹ nhàng với nhiệt độ tăng tối thiểu. Sự truyền nhiệt rất có thể bằng dẫn truyền, đối lưu, phản xạ hoặc sự kết hợp của chúng.Sấy phun là một cách thức làm thô đối giữ được triển khai bằng thứ sấy phun trong đó sử dụng lắp thêm phun áp lực nặng nề hoặc ly trung tâm hoặc những tia khí-lỏng để tạo ra các giọt hỗn hợp phun mịn khi tiếp xúc liên tục với khí rét chảy xoáy trong buồng hình nón (100- 300độ C). Size của phòng sấy phải sao để cho các giọt nước không đụng vào thành cho đến khi bọn chúng đủ khô để tránh bị dán và cháy. Khi thời gian sấy khoảng vài giây, nhiệt độ của các hạt vẫn ở mức thấp. Bột khô tích tụ làm việc đáy phòng từ chỗ nó được rước ra. Những ưu điểm chính của quá trình này là chuyển động liên tục, tạo nên các sản phẩm sinh học dạng bột với xử lý những vật liệu ko bền nhiệt mà lại không làm mất đi xứng đáng kể những tính năng chủ yếu của bọn chúng như cấu tạo phân tử (đối với những chất sinh sản màng sinh học như DNA, RNA, polysaccharide, protein với lipid), hoạt tính xúc tác (đối với enzym), năng lực hoạt động mặt phẳng (đối với protein ko xúc tác), và hoạt tính dược lý (đối cùng với thuốc).Làm khô ướp đông lạnh nhằm mục tiêu chuyển vật tư sinh học tập từ dạng hoạt động thành dạng ko hoạt động bằng phương pháp đóng băng (tốc độ làm lạnh từ bỏ 0,5 độ C / phút mang lại 5 độ C / phút) sau đó sa thải nước dưới áp suất phải chăng (thường trường đoản cú 0,1 mang đến 0,5mbar) và nhiệt độ được kiểm soát và điều hành (thường từ bỏ 15 độ C cho 30 độc C). Có tác dụng khô đông lạnh dựa trên thực tế là nước ướp đông lạnh thăng hoa thành khá nước dưới áp suất thấp. Nhiệt độ được truyền đến chất rắn đông lạnh chủ yếu bằng phương pháp dẫn từ 1 tấm gia nhiệt, tương đối nước dừng tụ ở ánh sáng thấp (bình ngưng bảo trì ở -40 độ C), và ánh nắng mặt trời chất rắn được điều chỉnh bằng phương pháp kiểm rà soát áp suất trong phòng sấy. Quá trình này rất có thể được chia thành sấy sơ cấp cho và sấy thứ cấp. Sấy sơ cấp loại bỏ nước thoải mái (khoảng thời hạn từ 10 đến 20 h), cùng sấy thứ cấp cho (thời gian khoảng 1 phần ba thời gian làm thô sơ cấp) loại trừ độ độ ẩm (ví dụ, nước kết tinh hoặc nước phân tán trong vật liệu thủy tinh). Mục đích của đông thô là thu được chất rắn bao gồm hàm lượng ướt tương tự với độ ẩm đơn lớp - cái gọi là hoạt độ nước - được đo lường và tính toán từ những đường đẳng nhiệt hấp thụ nước bằng phương pháp áp dụng các quy mô toán lý hóa đúng cách. Hoạt độ nước có thể được xem như là lượng nước buổi tối thiểu mà vật liệu đông thô giữ được tính năng tính năng chính của chính nó (ví dụ, một các loại enzyme sẽ bảo trì khả năng xúc tác của nó, kĩ năng phát triển của tế bào, một phương thuốc có hoạt tính dược lý và một các loại thực phẩm được bảo tồn kéo dãn dài thời gian). Fan ta đã báo cáo rằng nấm men đông khô bao gồm hoạt độ nước trường đoản cú 0 cho 0,33 (xấp xỉ giá chỉ trị nhiệt độ đơn lớp) để ở 25 độ C vào 235 ngày với ở 89 độ C vào 15 phút giữ lại ít nhất 85% hoạt tính invertase lúc đầu của nó, vào khi những mẫu có hoạt độ nước cao hơn giá trị hàm lượng độ ẩm một lớp làm mất đi ít độc nhất vô nhị 60% hoạt tính invertase của nó. <14> Sự thành công của quá trình đông khô dựa vào vào các điều kiện cơ mà bước ướp đông lạnh được thực hiện (bản hóa chất của hóa học đệm, độ p
H, vận tốc làm lạnh, và sự xuất hiện hay không có mặt của các chất đảm bảo an toàn lạnh như glycerol cùng polyethylene glycol 400). Đây là phương pháp nhẹ nhàng duy nhất trong các cách thức làm khô. Nhận được bột mịn với dễ hòa tan. Mặc dù nhiên, phương pháp này bao hàm nhược điểm như đầu tư chi tiêu vốn cao và ngân sách năng lượng, thời gian xử lý lâu, dễ hình thành hỗn hợp bọt bong bóng và eutectic. Rộng nữa, sự bất hoạt của các enzym có cấu trúc bậc bốn và các thụ thể protein của tế bào hoàn toàn có thể xảy ra.Phối trộn.Công thức là biện pháp một chế tác sinh học enzyme - sinh hoạt dạng dung dịch hoặc dạng bột hoàn toàn có thể được chào bán trên thị trường.Bản hóa học và độ thuần khiết của chế phẩm sẽ được xác định bởi những yêu cầu của ngành. Những enzym được áp dụng trong công nghiệp yêu cầu độ tinh khiết về tối thiểu và trong trường hợp gồm chất xúc tác ngoại bào vi sinh vật, chất nổi không có tế bào đông khô được cách xử lý để loại bỏ các thành phần có màu được chấp nhận. Đối với các enzym công nghiệp, tiến trình hạ nguồn được thiết kế theo phong cách để tăng hiệu lực thực thi hiện hành xúc tác trên mỗi trọng lượng với không đã đạt được độ trong sáng - bởi trong công nghiệp, câu hỏi giảm giá thành là then chốt, nên độ trong sáng của enzym phải ở mức tối thiểu. Trong một trong những trường hợp, các chế phẩm lếu hợp của các enzym được yêu cầu - ví dụ, amylase cùng với protease trong thêm vào nước cần sử dụng nấu bia và kích cỡ hàng dệt, glucose oxidase với catalase để sa thải các vệt glucose trong một số thực phẩm nhất mực (trứng khô) -, trong những trường hợp khác , láo hợp không mong muốn (amylase của nấm làm cho phụ gia bột mì bắt buộc không đựng protease, nếu không các axit amin hòa tan sẽ tiến hành giải phóng khỏi protein và gây ra không ít bọt và chuyển sang màu sắc nâu). Khía cạnh khác, những enzym dược phẩm (ví dụ như asparaginase, hyaluronidase) yêu cầu không cất pyrogen và các enzym sử dụng trong xét nghiệm lâm sàng ko được chứa những enzym cản trở tác dụng xét nghiệm. Vì chi phí nguyên liệu với lên men tương đối thấp, phải tỷ lệ phần trăm thu hồi toàn diện là hết sức quan trọng. Ví dụ: trường hợp một giao thức xuôi chiếc năm cách được tiến hành với năng suất 90% cho mỗi bước, thì nấc khôi phục sau cuối sẽ là 0,95 hoặc 60%. Việc áp dụng enzym hiệu lực cao gồm những ưu thế như ít bị thất thoát do rơi vãi trong quá trình sử dụng và ngân sách đóng gói và vận chuyển thấp.Các nhà thêm vào enzym công nghiệp tạo thành sản phẩm ở đầu cuối với các chất phụ gia (chất đệm, chất bất biến và chất kháng khuẩn), không chỉ là nhằm mục đích tăng thời hạn áp dụng và độ định hình của enzym, hơn nữa để tăng khối lượng, tiêu chuẩn hóa hoạt tính xúc tác của chế phẩm, và có tác dụng cho sản phẩm dễ quản lý hơn (có nghĩa là đơn giản hơn trường hợp thêm 10 kg enzym vào bể cách xử lý hơn 10 g).PHẦN KẾT LUẬN:Quy trình hạ mối cung cấp phải được thiết kế theo phong cách để thu được những enzym gồm độ tinh khiết say mê hợp. Các enzym nội bào, không dựa vào vào nguồn, luôn luôn yêu mong sự phá tan vỡ tế bào tức thì từ bước đầu tiên tiên. Mcerate được lọc, ly tâm hoặc keo tụ để tách các miếng vụn tế bào. Sau đó, phần nổi phía bên trên được cách xử trí với sự phối hợp của các vận động hạ mối cung cấp theo độ thuần khiết mà áp dụng enzym yêu cầu. Các enzym công nghiệp yêu mong mức độ tinh khiết tốt hoặc trung bình, trong khi các enzym chữa bệnh và đối chiếu phải tất cả độ trong sáng cao. Độ trong sáng cao hoàn toàn có thể đạt được bằng phương pháp xử lý hỗn hợp enzym thu được từ các quy trình tinh luyện thô trước đó (lọc và / hoặc kết tủa) với ít nhất hai kỹ thuật nhan sắc ký. Các bước ban đầu liên quan tiền đến thêm vào enzym ngoại bào của vi sinh vật bao hàm lọc huyền phù tế bào, tiếp nối là cô đặc dịch lọc. Vì đó, với khối lượng dịch lọc nhỏ, các vận động hạ nguồn tiếp theo sẽ được dễ ợt hơn cả về kích cỡ thiết bị và quá trình xử lý. Các chuyển động hoàn thiện (làm khô, trộn chế với đóng gói) cũng chính là khâu cốt yếu để bất biến chế phẩm enzyme cùng với thời hạn sử dụng ít nhất là 1 trong những năm. Thời hạn thực hiện dài rất đặc biệt quan trọng đối với các enzym được thực hiện làm dung dịch hoặc trong những quy trình phân tích.Nguồn:researchgate.netBiên dịch: xemdiemthi.edu.vn Team
